رنگ آمیزی اسپور
Endospore Staining
برخی از باکتری‌ها قادرند با تشکیل ساختارهای مقاوم به‌نام اندوسپور (اسپور) شرایط سخت محیطی را تحمل کنند و در شرایط مناسب مجددا به فرم رویشی تبدیل شوند. تولید اسپور در واقع یک نوع تمایز سلولی است زیرا که در این فرآیند آنزیم‌ها و ساختمان‌های جدید جایگزین آنزیم‌ها و ساختمان‌های قبلی می‌شوند، به‌طوری که آنتی ژن‌های مخصوص در مرحله اسپورولاسیون تولید می‌شود. در حالی که در مرحله فعال باکتری وجود ندارد. شرایط تغذیه‌ای نامناسب از جمله: تخلیه منابع کربن و نیتروژن مهم‌ترین عوامل تولید اسپور می‌باشند، هم‌چنین کمبود مواد انرژی‌زا، سولفات، فسفات و آهن تشکیل اسپور را تحریک می‌کنند.
اسپور یا اندوسپور در واقع مرحله استراحت و شکل مقاوم باکتری می‌باشد. همه باکتری‌ها قادر به تولید اسپور نیستند. باسیلوس‌ها و کلستریدیوم‌ها دو جنس مهم باکتریایی تولید کننده اسپور می‌باشند. سایر گونه‌های اسپور زا مثل: اسپوروسارسینا و کوکسیلابورنتی هستند.
در فرآیند اسپورولاسیون، هر باکتری فقط یک اسپور می‌سازد و از هر اسپور تنها یک باکتری بوجود می‌آید، بنابراین تولید اسپور در باکتری‌ها به‌عنوان یک فرآیند تکثیری به شمار نمی‌رود. در هر باکتری اسپوردار؛ شکل، اندازه و محل استقرار اسپور ویژگی ثابتی می‌باشد و این خصوصیات می‌تواند به‌عنوان کلید تشخیصی در شناسایی باکتری‌های اسپور زا و در آزمایشگاه بالینی مورد استفاده قرار گیرند.
به‌طور کلی موقعیت قرار گرفتن اسپور در سلول مادر به سه حالت: مرکزی(Central)، انتهایی(Terminal) و نزدیک انتهایی(Subterminal) می‌باشد و شکل اسپور، به‌صورت کروی (Spherical) و بیضی(Oval) مشاهده می‌شود. اندازه اسپور کلستریدیم‌ها بزرگ‌تر از سلول والد بوده و موجب تورم و تغییر شکل سلول مادر می‌شود ولی اندازه اسپور در جنس باسیلوس‌ها کوچک‌تر از سلول والد می‌باشد.
در سال 1922، Dorner روشی را برای رنگ‌آمیزی اندوسپورها ارائه داد. Shaeffer و Fulton روش Dorner را در سال 1933 اصلاح کردند تا این فرآیند را سریع‌تر کنند. رنگ اندوسپور یک رنگ افتراقی است که به‌طور انتخابی اندوسپورهای باکتریایی را رنگ می‌کند. هدف اصلی از رنگ‌آمیزی اندوسپور، افتراق اسپورهای (Spore) باکتری از سایر سلول‌های رویشی و افتراق ارگانیسم‌های تشکیل دهنده اسپور از غیر اسپور است.
اندوسپورهای باکتریایی، ساختارهای متابولیکی غیرفعال و بسیار مقاومی هستند که توسط برخی باکتری‌ها به‌عنوان یک استراتژی دفاعی در برابر شرایط محیطی نامطلوب تولید می‌شوند. باکتری‌ها می‌توانند در این حالت باقی بمانند تا زمانی که شرایط مساعد شود و بتوانند جوانه زده و به حالت رویشی خود بازگردند.
در روش Schaeffer-Fulton، یک رنگ اولیه به‌نام مالاشیت گرین (Malachite green) با بخار دادن امولسیون باکتری به داخل اسپور وارد می‌شود. مالاشیت گرین قابل حل در آب است و میل ترکیبی کمی با مواد سلولی دارد، بنابراین سلول‌های رویشی ممکن است با آب بی‌رنگ شوند. سپس سافرانین (Safranin) برای رنگ‌آمیزی ثانویه سلول‌هایی که رنگ‌زدایی شده‌اند به‌کار می‌رود. در پایان فرآیند رنگ‌آمیزی، سلول‌های رویشی صورتی و اندوسپورها سبز تیره می‌شوند.
اسپورها ممکن است در وسط سلول، در انتهای سلول یا بین انتهای و وسط سلول قرار گیرند. شکل اسپور ممکن است برای تشخیص بیماری نیز مفید باشد. اسپورها ممکن است کروی یا بیضوی باشند.
- یک لام تمیز بدون چربی بردارید و با استفاده از یک تکنیک استریل، اسمیر را به آن اضافه کنید.
- آن را با هوا خشک کنید و با حرارت ارگانیسم را روی یک لام شیشه‌ای ثابت کنید. سپس با یک کاغذ خشک‌کن مربعی یا یک تکه پارچه حوله‌ای روی لام را بپوشانید.
- کاغذ خشک‌کن را به محلول شماره یک (رنگ مالاشیت گرین) آغشته کنید و به مدت 5 دقیقه بخار دهید. کاغذ را مرطوب نگه دارید و در صورت نیاز رنگ بیش‌تری به آن اضافه کنید. یک راه دیگر این است که اسلاید را می‌توان روی یک ظرف آب جوش، بخار داد.
- لام را با آب لوله‌کشی بشویید.
- با محلول شماره دو (رنگ سافرانین) به مدت 30 ثانیه رنگ کنید. سپس آن را با آب لوله‌کشی بشویید و رنگ را خشک کنید.
- لام را زیر میکروسکوپ از نظر وجود آندوسپور بررسی کنید. اندوسپورها سبز روشن و سلول‌های رویشی قرمز مایل به قهوه‌ای تا صورتی هستند.
- اندوسپورها: اندوسپورها سبز روشن هستند.
- سلول‌های رویشی: سلول‌های رویشی قرمز مایل به قهوه‌ای تا صورتی هستند.
مثبت
کلستریدیوم پرفرنجنس (Clostridium perfringens)
کلوستریدیوم بوتولینوم (C. botulinum)
کلستریدیوم تتانی (C. tetani)
باسیلوس آنتراسیس (Bacillus anthracis)
باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)
گونه‌های دسولفوتوماکولوم (Desulfotomaculum)
گونه‌های اسپورولاکتوباسیلوس (Sporolactobacillus)
گونه‌های اسپوروسارسینا (Sporosarcina) و غیره.
منفی
اشریشیا کلی (E. coli)
گونه‌های سالمونلا (Salmonella) و غیره.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.