معرف محیط کشت MR-VP
Methyl Red and Voges-Proskauer Test Protocols
محیط کشت MR-VP دارای ترکیبات پپتیک، دکستروز، دی پتاسیم فسفات می‌باشد و در شناسایی باسیل‌های گرم منفی روده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد و یک محیط کشت افتراقی می‌باشد.
در سال ۱۸۹۸ Voges و Proskauer تخمیر قندها توسط باکتری‌های ایزوله شده مختلف را مشخص کردند. آن‌ها نشان دادند که گاز تولید شده در طی تخمیر مخلوطی از CO2 و H2 است و با افزودن KOH به کشت‌هایی که در محیط کشت پپتون گلوکز برای انکوباسیون طولانی مدت در حضور اکسیژن رشد کرده بودند، برخی از موجودات یک رنگ فلورسنت قرمز تولید کردند.
اگر چه ماهیت رنگ‌بندی در آن زمان مشخص نبود، این روش برای تمایز بین باکتریایی که رنگ را تولید می‌کنند و آن‌هایی که تولید نمی‌کنند پیشنهاد شد.
در سال ۱۹۰۶، آرتور هاردن محصولات تخمیر انتروباکتر آئروژنز را تجزیه و تحلیل کرد و دریافت که در حضور گلوکز، ارگانیسم استوئین و ۲،۳-بوتاندیول تولید می‌کند. هنگام آزمایش هر دو ترکیب در حضور KOH، هیچ کدام رنگ صورتی مایل به قرمز توصیف شده توسط Voges و Proskauer را تولید نکردند.
با این حال، افزودن پپتون به واکنش، رنگ‌بندی توصیف شده را در حضور استوئین به‌همراه داشت. هاردن پیشنهاد کرد که استوئین به دی استیل اکسید می‌شود که به نوبه خود با ترکیبات موجود در مخلوط پپتون واکنش داده و محصول رنگی را تشکیل می دهد. بعدها مشخص شد که وجود یک گروه گوانیدین (روی ترکیبی در پپتون) برای واکنش رنگ ضروری است.
هدف از استفاده معرف MR-VP
تست‌های متیل رد و Voges-Proskauer بخشی از مجموعه آزمایش‌های بیوشیمیایی هستند که به نام IMViC در آزمایشگاه بالینی استفاده می‌شوند. مخفف IMViC مخفف ایندول، متیل قرمز، Voges-Proskauer و سیترات است. “i” در مخفف برای تلفظ اضافه شده است.
در ابتدا از تست‌های MR-VP زوجی برای تمایز بین اعضای خانواده انتروباکتریاسه استفاده می‌شد، اما اکنون از آن‌ها برای مشخص کردن سایر گروه‌های باکتری از جمله اکتینوباکتریا استفاده می‌شود.
هر دو تست متیل رد و Voges-Proskauer معمولاً همراه با آزمایش‌های ایندول و سیترات استفاده می‌شوند تا گروهی از آزمایش‌ها به نام IMViC را تشکیل دهند که به تمایز انتروباکتریا کمک می‌کنند.
اشریشیا کلی (Escherichia coli) و سایر اعضای ارگانیسم‌های کم نسبت توصیف شده توسط کلارک و لوبس، قندها را از طریق مسیر اسیدی مخلوط تخمیر می‌کنند و در نتیجه نسبت کم CO2 به گازH2 حاصل از تخمیر تولید می‌شود.
متیل رد یا ۲-N و N دی متیل ۴- آمینو فنیل آزوبنزن کربوکسیلیک اسید معرف pH است.
فرمول شیمیایی متیل رد C15H15N3O2و دارای دو حلقه بنزن، یک گروه عاملی کربوکسیلیک اسید و یک گروه دی متیل آمین است که حلقههای بنزن توسط گروه آزو به یکدیگر متصل شده‌اند.
مسیر اسید مخلوط ۴ مول محصولات اسیدی (عمدتا اسید لاکتیک و استیک)، ۱ مول محصول تخمیر خنثی (اتانول)، ۱ مول CO2 و ۱ مول H2 به ازای هر مول گلوکز تخمیر شده می‌دهد.
مقدار زیاد اسیدهای تولید شده باعث کاهش قابل توجهی در pH محیط کشت می‌شود. در مقابل، انتروباکتر آئروژن ها و دیگر اعضای ارگانیسم های با نسبت بالا (آن‌هایی که نسبت بالایی از CO2 به H2 را از تخمیر گلوکز تولید می‌کنند) قندها را از طریق مسیر تخمیر بوتاندیول تخمیر می‌کنند و تنها ۱ مول اسید در هر مول گلوکز تولید می‌کنند.
این مسیر منجر به درجه کمتر اسیدی شدن محیط کشت می‌شود.
هنگامی که محیط کشت پس از افزودن متیل رد قرمز می‌شود، به دلیل PH در ۴.۴ یا کمتر از تخمیر گلوکز، کشت یک نتیجه مثبت برای آزمایش MR دارد . آزمایش MR منفی با رنگ زرد در محیط کشت نشان داده می‌شود که زمانی رخ می دهد که اسید کمتری (PH بالاتر) از تخمیر گلوکز تولید شود.
وضعیت ظاهری: پودر قرمز تیره تا قرمز بنفش
چگالی: ۰.۷۹۱ گرم بر سانتیمتر مکعب
نقطه ذوب: ۱۸۲-۱۷۹ درجه سانتیگراد
حلالیت: محلول در اتانول
- در هیستوپاتولوژی برای نمایش ماهیت اسیدی بافت و حضور ارگانیسمهایی با دیواره سلولی اسیدی
- عامل فلورسانس
- تمایز باکتری‌ها از نظر تولید اسید
خوشبختانه متیل رد در زمره ترکیبات خطرناک و مسمومکننده نیست و در صورت تماس با پوست و چشم کافی است موضع با آب شسته شود و در صورت بلع به فرد آب نوشانده شود.
در اثر اشتعال این ترکیب گازهای نیتروژن و نیتروژن اکسید تولید می‌شود؛ بنابراین حین اطفای حریق این ترکیب باید از دستگاه تنفس فردی استفاده نمود.
معرف آلفا نفتول و معرف پتاس (VP)
Voges-Proskauer
بعضی از باکتری‌ها زمانی که در محیط کشت‌های خاصی کشت داده می‌شوند، محصولات نهایی خنثی تولید می‌کنند. باکتری‌های خاص روده‌ای که گلوکز را تخمیر می‌کنند، بیش‌تر متابولیزهای پیروویک اسید به صورت استوئین می‌باشد.
این محصول نهایی، در حضور اکسیژن و هیدروکسید پتاسیم به دی استیل تبدیل می‌شود. دی استیل در حضور آلفا نفتول به یک ترکیب قرمز تبدیل می‌شود.
قندهای تخمیرکننده باکتری از طریق مسیر بوتاندیول استوئین (به‌عنوان مثال استیل متیل کاربینول یا ۳-هیدروکسی بوتانون) را به عنوان یک واسطه تولید می‌کنند که می‌تواند بیش‌تر به ۲،۳-بوتاندیول کاهش یابد.
در حضور KOH، استوئین میانی به دی استیل اکسید می‌شود، واکنشی که توسط a-naphthol کاتالیز می‌شود. دی استیل با گروه گوانیدین مرتبط با مولکول های ایجاد شده توسط پپتون در محیط واکنش می‌دهد و محصولی به رنگ صورتی مایل به قرمز تشکیل می‌دهد .
a-naphthol در اصلاح Barritt در تست VP به‌عنوان یک تشدید کننده رنگ عمل می‌کند.
در این تست محیط کشت MR-VP که میکروارگانیسم به آن تلقیح شده است، مورد استفاده قرار می‌گیرد. انکوباسیون ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد انجام می‌شود.
۱ میلی لیتر از محیط کشت انکوبه شده را به یک لوله آزمایش تمیز انتقال دهید و ۱۵ قطره آلفا نفتول اضافه کنید و سپس ۵ قطره محلول ۴۰ درصد پتاس بریزید. به آرامی تکان دهید.
ظاهر شدن رنگ قرمز در عرض ۲۰ دقیقه را بررسی کنید. اگر تست ۲۴ ساعته منفی باشد، تست را با آزمایش ۴۸ ساعته تکرار کنید. اگر نتایج معکوس بدست آید، تست را با محیط کشت‌هایی که به مدت ۵ روز در ۲۵ تا ۳۰ درجه سانتی گراد انکوباسیون شده‌اند، تکرار کنید.
