بافر TBE
بافر یک جزء مهم در هر واکنش بیولوژیک است. بافر بیولوژیک ترکیبی از اسید ضعیف و باز مزدوج یا برعکس است که به ثابت نگه داشتن pH محلول کمک می کند. Tris-borate EDTA و Tris-acetate EDTA دو نوع متداول محلول بافری مورد استفاده در الکتروفورز ژل آگارز DNA هستند.
ویژگی‌های بافر الکتروفورز TAE
عملکرد و وظایف بافر الکتروفورز:
pH واکنش را تقریباً خنثی نگه می‌دارد. اسید و باز ضعیف موجود در بافر، pHرا در محدوده مورد نظر نگه می‌دارند.
با حفظ pH خنثی، بار خالص مولکول‌ها را کنترل می‌کند که به مهاجرت و جداسازی صحیح مولکول کمک می‌کند.
بافر الکتروفورز ژل DNA، از حمله DNase به DNA جلوگیری می‌کند. هم‌چنین این بافر با فراهم کردن یک محیط مایع ثابت، از هیدرولیز مولکول‌های DNA جلوگیری می‌کند.
محیط مایع تغییرات دما را در طول الکتروفورز ژل کنترل می‌کند. ولتاژ بالا دمای ژل آگارز را افزایش می‌دهد که می‌تواند منجر به دناتوره شدن DNA شود. این افزایش جزئی دما، توسط محیط مایع بافر کنترل می‌شود.
بافر در طول الکتروفورز، بار را به طور مساوی توزیع می‌کند
تریس یک باز قوی و بورات یک اسید است، ترکیب این دو، PH را تقریباً خنثی و در محدوده 8 تا 8.5 حفظ می‌کند. تحت این شرایط قلیایی، DNA محافظت می‌شود و می‌تواند به درستی جدا شود.
EDTA نقش مهمی در بافر الکتروفورز دارد. EDTA یک عامل چلاته کننده است. این یون Mg2+ را که کوفاکتور آنزیم DNAse است، چلاته می‌کند. DNAse آنزیمی است که DNA را به قطعات کوچک تقسیم می‌کند. بنابراین با افزودن EDTA، DNA از فعالیت آنزیمی محافظت می‌شود.
بافر الکتروفورز هم‌چنین بار مولکول‌های آب را خنثی می‌کند. تحت جریان الکتریکی، مولکول آب به H+ و OH- تجزیه می‌شود. یون‌های H+ می‌توانند با گروه‌های فسفات DNA واکنش دهند. بنابراین بار منفی بافر، بار آب را خنثی می‌کند و از DNA محافظت می‌کند
اگرچه بافر TAE و بافر TBE در الکتروفورز یکسان عمل می‌کنند، اما هر دو مزایا و معایب خاص خود را دارند.
بافر TAE می‌تواند در واکنش آنزیمی DNAse مداخله کند و از DNA محافظت کند، در مقابل، بافر TBE نمی‌تواند.
TAE ظرفیت بافر کم‌تری دارد در حالی که TBE ظرفیت بافری بالاتری نسبت به بافر TAE دارد.
بورات موجود در TBE می‌تواند با قند موجود در ساختار DNA واکنش دهد، بنابراین استفاده از آن همیشه توصیه نمی‌شود.
اگر گلیسرول در DNA Loading Dye موجود باشد، TBE انتخاب مناسبی نیست. بورات با گلیسرول واکنش می‌دهد و عملکرد رنگ بارگذاری DNA را کاهش می‌دهد. بنابراین اگر گلیسرول جزء اصلی در رنگ بارگذاری DNA باشد، بافر TAE بهترین انتخاب برای به دست آوردن نتیجه خوب است.
ظرفیت بافر کم‌تری نسبت به TBE دارد بنابراین با استفاده مکرر عملکردش ضعیف می‌شود.
رسانایی بافر TAE بهتر از TBE است بنابراین dsDNA می‌تواند سریع‌تر در آن حرکت کند.
DNA را می‌توان به‌راحتی در بافر TAE ریکاوری کرد بنابراین نرخ ریکاوری در بافر TAE بالاتر از TBE است.
بافر TAE مقرون به صرفه و ارزان تر از سایر سیستم‌های بافری است، علاوه بر این، در غلظت‌های پایین‌تر به‌عنوان working solution مورد استفاده قرار می گیرد.